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本制品是一款采用TaqMan探针法进行Real-Time qPCR的试剂，是将HotStart Taq DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs（含dUTP）、精心优化的反应Buffer、保护剂及赋形剂等试剂制成的试剂盒，进行实验时，PCR反应液的配制简单方便。经特殊工艺处理后的HotStart Taq DNA聚合酶可以有效减少由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。结合精心优化的反应缓冲液，具有很高的特异性和灵敏度。本制品包含无甘油的2×Mix、冻干保护剂及赋形剂，可直接用于冻干样品的制备，以提高样品的稳定性和易用性。

• 该产品可用于制作冻干粉或冻干小球，可添加引物探针进行冻干；
  
• 高特异性：采用特殊工艺制备的HotStart Taq DNA聚合酶，结合精心优化的反应缓冲液，大大提高PCR扩增的特异性；
  
• 高效：精心配制的Real-Time qPCR专用2×SuperMix，具有更高的扩增效率和扩增灵敏度；
  
• 快捷：PCR反应所必需试剂集于一管之中，数分钟即可完成反应体系配制。

• 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
  
• qPCR灵敏度高，建议将模板进行稀释使用，控制Ct值在20～35之间适宜。
  
• 本制品中已含有冻干辅料，若需增加其他冻干辅料，需根据实际检测数据评估后增加。
  
• 复溶后产品使用若有剩余，请将本制品置于-20℃±5℃储存，尽量避免反复冻融，影响产品使用。

• 冻干前样品检测：若需要在冻干前进行样品检测，可根据以下体系进行，常用反应体系（20μL）：
  
  • 使用2×高特异探针法qPCR SuperMix(UDG，无甘油)，不使用4×冻干保护缓冲液进行检测验证：
    

    成分	用量
    2×高特异探针法qPCR SuperMix(UDG，无甘油)	10μL
    上游引物(10μM)	0.2～1.0μM(终浓度)
    下游引物(10μM)	0.2～1.0μM(终浓度)
    探针(10μM)	0.05～0.5μM(终浓度)
    模板	X μL
    RNase-Free Water	至20μL

  • 使用2×高特异探针法qPCR SuperMix(UDG，无甘油)，使用4×冻干保护缓冲液进行检测验证：
    

    成分	用量
    2×高特异探针法qPCR SuperMix(UDG，无甘油)	10μL
    4×冻干保护缓冲液	5μL
    上游引物(10μM)	0.2～1.0μM(终浓度)
    下游引物(10μM)	0.2～1.0μM(终浓度)
    探针(10μM)	0.05～0.5μM(终浓度)
    模板	X μL
    RNase-Free Water	至20μL

• 冻干小球体系制备：
  
  • 根据以下常用体系（20μL）进行冻干小球体系配制：
    

    成分	用量
    2×高特异探针法qPCR SuperMix(UDG，无甘油)	10μL
    4×冻干保护缓冲液	5μL
    上游引物(10μM)	0.2～1.0μM（终浓度）
    下游引物(10μM)	0.2～1.0μM（终浓度）
    探针(10μM)	0.05～0.5μM（终浓度）
    RNase-Free Water	至20μL

  • 将上述冻干微球进行冻干，推荐冻干程序如下：
    

    步骤	温度 (℃)	斜率时间 (min)	持续时间 (min)	真空度 (Pa)	备注
    进仓	-45	/	60	/	需保证箱体温度下降至-45℃才可放入
    预冻	-45	60①	240②	/	①预冻斜率时间进行快速率降温； ②持续时间根据包材、体积数量进行调整；
    一次升华	-45	120③	600④	10	③斜率时间根据冻干机升降温速率及一次升华温度进行调整； ④持续时间根据包材、体积数量进行调整；
    解析干燥	0	120⑤	60⑥	10	⑤斜率时间根据冻干机升降温速率及一次升华温度进行调整； ⑥持续时间根据包材、体积数量进行调整；
    	25	120⑦	240⑧	0	⑦斜率时间根据冻干机升降温速率及一次升华温度进行调整； ⑧持续时间根据包材、体积数量进行调整。

    • 不同厂家或不同型号冻干机均会存在差异，请根据冻干机性能优化程序；
      
    • 若冻干机无斜率控制，请将升温过程分阶段进行；
      
    • 此推荐程序为西林瓶耗材（50瓶以内）冻干程序，若冻干体积更大或数量更多，需对冻干程序调整；
      
    • 冻干后建议使用高纯氮气进行填充。
  • 使用(20-X)μL RNase-Free Water复溶冻干微球，加入X μL模板进行反应，反应时总体积为20μL，即：
    

    成分	用量
    冻干微球	1颗
    加入(20-X)μL的RNase-Free Water混匀复溶。
    模板	Xμl
    总体积	20μL

• 推荐PCR反应程序：
  

  反应阶段	循环数	温度	时间
  污染消化	1	37℃	2min
  预变性	1	95℃	5min
  变性	40～45	95℃	10s
  退火/延伸		60℃	30s